5 Schritte der Gensynthese

Die Gensynthese ist der biologische Prozess der Neubildung von Genen aus Nukleotiden. Künstliche oder synthetische Gensynthese unterscheidet sich von der DNA-Synthese in lebenden Zellen. Der wesentliche Unterschied besteht darin, dass sie keine DNA-Vorlage benötigt. Sie ermöglicht die Herstellung synthetischer DNA-Moleküle, deren Größe und Nukleotidsequenz nicht beschränkt sind. Zudem lassen sich beliebige Sequenzen kopieren und synthetisieren, unabhängig davon, ob sie natürlich vorkommen oder nicht. Die Erforschung und Weiterentwicklung der Gensynthese hat zu großen Fortschritten in der Biologie geführt, wodurch Wissenschaftler nun ganze Genome und Zellen problemlos umprogrammieren können.

Zu den wissenschaftlichen Vorteilen der Gensynthese gehören:

Die Gensynthese wurde von Forschern genutzt, um die Bedingungen herauszufinden, unter denen sich Brustkrebs-Tumorzellen vermehren. Dies hat eine Grundlage für die Entwicklung von Therapien geschaffen, die Krebs wirksam behandeln können.
Wenn Wissenschaftler die Virussequenzierung mithilfe künstlicher Gensynthese durchführen, entstehen sicherere und wirksamere DNA-basierte Impfstoffe.
Die Chanel-Rhodopsin-Variante ermöglicht die Aktivierung tiefer Gehirnneuronen durch nicht-invasive optische Aktivierung.
Pflanzenbiologen können die Gensynthese nutzen, um die Neuprogrammierung der Entwicklung im Gefäßgewebe der Pflanzen zu untersuchen. Bei der Durchführung solcher Studien kann das Einfrieren zur Konservierung von Genproben eingesetzt werden. Mit dieser Einstellung, Schauen Sie sich diese Gefriertrockner an die sich ideal zur Konservierung temperaturempfindlicher Materialien eignen.

Schritte bei der Gensynthese

Wissenschaftler folgen bei der Durchführung der Gensynthese einem fünfstufigen Prozess. Die fünf Schritte sind:

Oligo-Design und Sequenzoptimierung
Oligo-Synthese
Genassemblierung
Überprüfung und Korrektur
Vorbereitung der synthetischen DNA

1. Oligo-Design und Sequenzoptimierung

Der erste Schritt in diesem Prozess ist die Auswahl des Gens, das Sie interessiert. Nach der Isolierung des Gens müssen Sie die Sequenz erstellen, die Sie synthetisieren möchten. Wenn Sie beispielsweise die Expressionsniveaus heterologer Proteine maximieren möchten, ist die Optimierung der Codons der ideale Weg. Andererseits ist dieser Prozess möglicherweise nicht sinnvoll, wenn Sie die interne Regulierung der Genexpression untersuchen möchten. Hier sind die beliebtesten Tools für den Oligo-Designprozess und ihre Vor- und Nachteile:

DNA funktioniert: Sie ist einfach zu verwenden und kann das Ergebnis einer Oligo-Fehlhybridisierung vorhersagen. Allerdings bieten die auf Simulationen basierenden Ergebnisse möglicherweise keine genaue Darstellung des tatsächlichen Erfolgs bei der Montage.
Gene2Oligo: Die Schnittstelle ist einfach zu verwenden und verfügt sowohl über LCR- als auch PCR-basierte Baugruppen. Andererseits ist es nicht sinnvoll, wenn Ihr Gen länger als ein Kilobyte ist.
TMPrime: TMPrime: Es bietet sowohl LCR- als auch PCR-basierte Baugruppen und einen breiten Bereich an Schmelz- und Glühtemperaturen. Der einzige Nachteil besteht darin, dass unerfahrene Benutzer die Benutzeroberfläche als kompliziert empfinden könnten. Für genaue Übermittlungen müssen die Benutzer verschiedene Eingabeparameter verstehen.

Wenn Sie die zu synthetisierende Sequenz finalisiert haben, besteht der nächste Schritt darin, das Gen in kleinere Fragmente zu unterteilen, um es zu synthetisieren und zusammenzusetzen. Zu den Faktoren, die diesen Schritt beeinflussen, gehören die Oligo-Länge, die Tendenz zur Haarnadelbildung und Sequenzwiederholungen.

2. Oligosynthese

Der erste Schritt der DNA-Synthese ist die Bildung kurzer Oligonukleotide. Wissenschaftler erreichen dies, indem sie die Phosphoramidit-Chemie nutzen, um Nukleotidmonomere zusammenzufügen. Die Phosphoramidit-Chemie ist vorteilhaft, da sie verhindert, dass der wachsende Strang während des Bildungsprozesses unerwünschte Reaktionen eingeht. Sie verbinden die Phosphoramiditgruppe mit dem 3'O, um unerwünschte Verzweigungen während der Bildung zu verhindern. Die Phosphoramidit-Gruppe enthält Diisopropylamin, das Schutz bietet, und methyliertes Phosphit. Der vierstufige Phosphoramidit-Reaktionszyklus ist wie folgt:

Entschützung: Hier wird DMT durch Waschen mit einer milden Säure wie Trichloressigsäure entfernt. Dadurch wird das 5'O für Reaktionen freigelegt.
Kopplung: Das 3'O des zweiten Nukleotids verbindet sich mit dem 5'O des ersten Nukleotids.
Capping: Hier helfen alle 5'OHs eines Nukleotids, das nicht akolytiert wurde, so, dass es im weiteren Verlauf des Prozesses nicht zu unerwünschten Reaktionen kommt.
Oxidation: Hier fügen sie Jod hinzu und bilden aus der Phosphattriesterbindung eine Phosphodiesterbindung, die zur Bildung des Rückgrats der DNA führt.

Experten führen diesen Schritt mithilfe einer Laborsäule oder eines speziellen Synthesizers durch.

3. Genassemblierung

Der Schritt zielt darauf ab, die fragmentierten Oligos entweder zu vollständigen Genen oder zu Bausteinen für Genome zusammenzusetzen. Bei der Genassemblierung sind vier Arten der Assemblierung nützlich. Die Wirksamkeit der Genassemblierungsmethode hängt von der Länge der Sequenz ab, die kombiniert werden soll. Die gebräuchlichsten Montagemethoden sind:

Ligase-Kettenreaktion oder LCR: Sie verwenden DNA-Ligase, um die überlappenden Enden synthetischer Oligos zu verbinden.
Polymerase-Kettenaufbau: Sie vereinen alle einsträngigen Oligos in einem Röhrchen und führen dann einen Thermocycling durch, um die Verbindung zu erleichtern.
Homologe In-vivo-Rekombination in Hefe: Ideal für lange Nukleotidstränge von bis zu 200 Nukleotiden und 1000 Bp.
Sequenz- und ligationsunabhängiges Klonen: Sie verwenden einen Plasmidvektor, um bis zu fünf Genfragmente zusammenzusetzen. Sie tun dies, indem sie es in den Plasmidvektor einbauen.

4. Überprüfung und Korrektur

Im vierten Schritt geht es darum, den erstellten Ablauf zu überprüfen und etwaige Fehler, die dabei aufgetreten sein könnten, zu beheben. Dazu gehört auch, alle Sequenzen zu testen, bevor sie zur Nutzung freigegeben werden. Alle Sequenzen, die Mutationen aufweisen, werden aus dem gesammelten Pool entfernt. Weitere Prozesse, die Teil der Qualitätskontrolle sind, sind:

Einfügungen
Streichungen
Frühzeitige Kündigung

Manchmal können die Experten aus dem Pool synthetisierter DNA nicht die richtige Sequenz für die Amplifikation ermitteln. Dabei nutzen sie verschiedene Methoden, um Fehler zu erkennen und zu beheben. Die Wissenschaftler entscheiden sich möglicherweise für eine stringente Hybridisierung sorgfältig entwickelter Oligos. Sie könnten sich auch für die Elektrophorese als umfassende Reinigungsmethode entscheiden. Eine weitere praktikable Option ist die Massenspektrometrie. Welche biochemische Methode sie verwenden, hängt davon ab, wie erfolgreich sie bei der Reinigung der DNA sein wird.

Zu den weiteren Methoden, die sie verwenden, gehört die Mismatch-Bindung, die auch als Mismatch-Spaltung bezeichnet wird. Dabei nutzen sie prokaryotische Endonukleasen, ein Verfahren, bei dem funktionelle Assays zur Korrektur der korrekten Sequenzen eingesetzt werden.

Bevor man mit dem Prozess beginnt, sollte man sich darüber im Klaren sein, dass nur etwa ein Drittel des gesamten synthetisierten Produkts die gewünschte Qualität haben wird. Um den Prozess zu vereinfachen, klonen sie nur Stränge, bei denen festgestellt wurde, dass sie keine Fehler aufweisen. Arbeiten Sie mit einem Labor oder Programm, das versteht

5. Vorbereitung der synthetischen DNA

Dies ist der letzte Schritt im Prozess. Hier wird die synthetische DNA für nachgelagerte Anwendungen vorbereitet. Zu dieser Vorbereitung für benutzerseitige Anwendungen gehören mehrere Prozesse:

Klonen: Sie klonen die synthetischen Gene in nützliche Vektoren, darunter Plasmid- oder Virusvektoren. Manchmal entwerfen die Experten synthetische Gene, die Enzymstellen, rekombinante Arme und andere angrenzende Sequenzen einschränken.
Vermehrung: Die synthetischen Gene sind aus mehreren Gründen schwierig zu vermehren. Erstens fällt es Experten schwer, Plasmidkonstrukte mit geringer Kopienzahl mithilfe von Bakterienwirten zu amplifizieren. Außerdem verändern einige Gene die Physiologie ihrer Wirte, und schließlich erschöpfen lange Gene die Wirtszelle aufgrund der Energiebelastung, die sie auf sie ausüben. Manchmal müssen sich die Experten mit Genen auseinandersetzen, die bei bestimmten Wirten toxisch und bei anderen harmlos sind. Wissenschaftler werden versuchen, den idealen Bakterienwirt für den Erfolg des Vermehrungsprozesses zu identifizieren.
Biologische Sicherheit: Schließlich erhalten die zuständigen Stellen Berichte über das verwendete Verfahren, bewerten die Beweise und stellen fest, ob das resultierende Produkt für die allgemeine Bevölkerung sicher ist. Der Recombinant DNA Advisory Committee überprüft beispielsweise die Protokolle, um sicherzustellen, dass die Sicherheit gewahrt bleibt und das Produkt kein Risiko für die Umwelt darstellt.

Fazit

Die Gensynthese ist sehr vorteilhaft, wenn sie richtig durchgeführt wird. Diese fünf Schritte führen Sie durch den Prozess. Wenn Sie über die Schaffung eines synthetischen Gens für einen beliebigen Zweck nachdenken, wenden Sie sich unbedingt an Experten, um sicherzustellen, dass Sie den richtigen Schritt in der genauesten Reihenfolge ausführen.